产品货号：
SY1324
中文名称：
细胞样本直接RT-qPCR试剂盒(荧光探针法)
英文名称：
Hiper Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit
产品规格：
40T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒适用于对各种动物细胞进行基因定量表达分析(如cell line化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS细胞等)，无需提RNA，可直接进行qPCR表达分析，用时短，操作简单，出错率低，最短只需1.5h就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。试剂盒中包含反转录以及定量检测试剂，可轻松地进行基因表达分析。
| 组分 | 规格 |
| FCD Lysis Buffer | 2mL |
| FCD Washing Buffer | 20mL |
| FCD Stop Solution | 100μL |
| DNase I | 80μL |
| 4×Histan FCD RT Mix | 200μL |
| 2×Hiper FCD Probe qPCR Mix | 2mL |
| RNase-Free H2O | 2mL |
保存：-20℃，有效期1年。
- FCD Lysis Buffer和FCD Washing Buffer未开封时请置于-20℃保存，融解后置于4℃保存。
- 使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
- 实验时，请尽量使用无污染的耗材，避免污染。
- 本制品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。
- 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
- 本制品仅作科研用途。
- 裂解产物的制备
- 将试剂放置室温下融化，使用前上下颠倒，轻轻混匀，并轻微离心后使用，避免起泡。
- 没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配制试剂等会导致反应性能下降。
- 将细胞转移至离心管中，5000rpm离心2min收集细胞，充分吸除培养基。若细胞在96孔板中培养，可直接吸除培养基。
- 50μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1×102～106cells，若细胞数量较多，可适当等比例增加FCD Lysis Bufer溶液和DNase I溶液的用量。
- 不同细胞的离心条件不同，请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。
- 50μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1×102～106cells，若细胞数量较多，可适当等比例增加FCD Lysis Bufer溶液和DNase I溶液的用量。
- 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150μL，吸打清洗细胞，5000rpm离心2min，吸尽FCD Washing Buffer。
- 各孔中加入48μL FCD Lysis Buffer溶液，2μL DNase I溶液，室温吸打混匀后静置5min，孵育后加入2.5μL FCD Stop Solution，吸打混匀5次左右，即可得到裂解产物，细胞数量超过1×105cells时可能会有裂解残留物属正常现象。
- 50μL的裂解液需加入2.5μL的FCD Stop Solution。依实验需要，加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。
- 细胞裂解产物溶液长期保存时，请置于-20℃。
- 50μL的裂解液需加入2.5μL的FCD Stop Solution。依实验需要，加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。
- 将试剂放置室温下融化，使用前上下颠倒，轻轻混匀，并轻微离心后使用，避免起泡。
- 反转录反应
- 室温融化4×Histan FCD RT Mix后轻微颠倒混匀，置于冰上并按下表配制反应体系：
成分 用量 终浓度 4×Histan FCD RT Mix 5μL 1× 裂解产物 x μL - RNase-Free H2O 至20μL - - 避免吸入细胞碎片，推荐使用量为2μL，最大不超过反应体系的55%。
- 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行反转录反应。
反应温度 反应时间 37℃ 5min 85℃ 5sec - 反转录温度推荐使用37℃，反转录产物可直接进行下游qRT-PCR检测。
- 为避免反转录体系对qPCR反应的抑制，得到合适的Ct值(10～35)，可将产物稀释10～1000倍后使用。
- 若短时间内不进行下游实验，可放置于-20℃保存。
- 反转录温度推荐使用37℃，反转录产物可直接进行下游qRT-PCR检测。
- 室温融化4×Histan FCD RT Mix后轻微颠倒混匀，置于冰上并按下表配制反应体系：
- 荧光定量PCR
- qPCR体系配制：使用下列成分比例在冰上配制反应体系。
成分 用量 终浓度 2×Hiper FCD Probe qPCR Mix 12.5μL 1× Forward Primer(10μM) 0.5μL 200 nM Reverse Primer(10μM) 0.5μL 200 nM Probe(10μM) 0.25～1μL 100～400 nM 反转录产物 x μL - RNase-free H2O 至25μL - - 高浓度模板易导致非特异扩增，可适当将模板稀释5～50倍，模板推荐用量4μL。
- 反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物探针浓度。
- 高浓度模板易导致非特异扩增，可适当将模板稀释5～50倍，模板推荐用量4μL。
- 荧光定量PCR快速扩增程序(推荐)
本制品推荐使用快速程序扩增，可大大减少反应时间。使用Tm值较低的引物难以扩增时，可额外调整退火温度。步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 10sec 1 变性 95℃ 5sec 45 退火/延伸 60℃ 10sec - 退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。
- 快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。
- 退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。
- 荧光定量PCR常规扩增程序
实验仪器不满足快速反应时间时，也可使用常规程序进行扩增。步骤 温度 时间 循环数 预变性 95℃ 10sec 1 变性 95℃ 15sec 40～45 退火/延伸 60℃ 30sec
- qPCR体系配制：使用下列成分比例在冰上配制反应体系。
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